Оценка влияния компонентов фибринового герметика на клетки
Аннотация: за последнее столетие было проведено множество исследований
для оценки влияния компонентов фибринового герметика (ФС)
на клетки. Из-за нековалентной связи тромбина с
фибрин во время образования фибринового сгустка мы хотели дополнительно оценить
влияние фибрин-связанного тромбина на жизнеспособность клеток. Первоначально,
мы количественно определили активность тромбина в трех различных,
коммерчески доступный FS. Эта информация была использована для подготовки
фибриновые сгустки, охватывающие диапазон концентраций тромбина
от 4 до 820 МЕ мл 1, но которые были идентичны в отношении
ко всем остальным избирателям. Хотя этих фибриновых сгустков не было
различаются по своей трехмерной структуре сгустки, приготовленные с помощью
высококонцентрированный тромбин (820 МЕ мл 1) не смог поддержать
адгезия и распространение первичных кератиноцитов человека
(NHEK). Количество присоединенных клеток также было значительно увеличено
снижается при высокой тромбиновой активности сгустков крови. Мы предположили, что
эти наблюдения являются не только следствием снижения
пролиферации, но апоптотических механизмов, так как экспрессия
расщепленных каспаз 3 и 7 был сильно усилен на
фибриновые сгустки с высокой активностью тромбина. Это сопровождалось
путем индукции экспрессии Trail-R2, который является рецептором
известно, что он опосредует сигналы апоптоза. Блокирование активности тромбина
к гирудину привело улучшение морфологии клеток
и к увеличению числа присоединенных клеток. В дополнение,
индукция каспаз 3 и 7 также была снижена. Таким образом, здесь
мы впервые сообщаем о том, что фибрин-связанный тромбин делает это
не только уменьшить распространение (как уже было опубликовано
другие), он также индуцирует апоптоз NHEK, когда присутствует в
высокая концентрация. VC 2012 Wiley Periodicals, Inc. J Биомед Матер
Res Part A: 100A: 1239-1247, 2012.
Ключевые слова: тромбин, фибриновый герметик, кератиноциты, жизнеспособность клеток.,
Апоптоз
ВСТУПЛЕНИЕ
Доказано, что фибриновые герметики эффективны при гемостазе
и запечатывание тканей, и заживление ран.1-3 в целом,
ФС состоят из двух основных составляющих. Один из них очень концентрированный
раствор фибриногена, содержащий фактор XIII и другие вещества
белки плазмы, такие как альбумин или фибронектин в количествах
это зависит от процесса очищения.1,4,5 другой компонент
представляет собой раствор тромбина и хлорида кальция, который
активирует фибриноген для образования фибринового сгустка. Их несколько
коммерчески доступные ФС на рынке с одобрением для
различные показания: TisseelVR (Baxter AG, Вена), ArtissVR
(Baxter AG, Вена), BeriplastVR (CSL Behring, Пенсильвания),
и EvicelVR (Ethicon, NJ) - это лишь несколько примеров. Они отличаются друг от друга
в своем составе и особенно в тромбин
концентрация (см. таблицу I).6 хотя ФС в настоящее время указаны
для гемостаза, герметизации или склеивания (например, кожи
трансплантаты), недавно использовавшиеся в клинических исследованиях в качестве доставки клеток
матрица для содействия заживлению ожоговых ран или использования в
эстетические операции вызвали у нас интерес к изучению клеточных
совместимость этих продуктов.7 кератиноциты играют a
ключевая роль в заживлении ран кожи при их повторной эпителизации
область раны.8,9 комбинированное применение кератиноцитов и А
фибриновая матрица для регенерации кожи впервые была описана в
1988.10 с тех пор появился подход к объединению изолированных кератиноцитов
с соответствующей фибриновой матрицей было проведено дальнейшее исследование
многими другими.11,12 совсем недавно, Сесе, Коул и
Тавил.13 сообщили о снижении пролиферации NHEK при высоком уровне
концентрация тромбина. В предыдущем исследовании мы обнаружили, что
два продукта FS ArtissVR и EvicelVR сильно отличаются друг от друга
их совместимость с клетками, участвующими в восстановлении мягких тканей
(кератиноциты, фибробласты, эндотелиальные клетки). В то время как
ArtissVR способствовал адгезии, распространению и росту
исследованные типы клеток, Execelvr не смогли поддержать такие клеточные
функции.14 потому что концентрация тромбина
эти два продукта существенно отличаются ( 4 МЕ мл 1
в Артиссвр и 800-1200 МЕ мл 1 в Экселвр), мы
Для корреспонденции: Pasteiner Вт; электронная почта: Адрес электронной почты защищен от спам-ботов. Для просмотра адреса в вашем браузере должен быть включен Javascript.
VC 2012 WILEY PERIODICALS, INC. 1239
Таблица I. Тромбиновая активность тромбинового компонента и поверхности фибринового сгустка
Материалы
Определяется Тромбин
Концентрация
тромбин
Компонент
Спецификация как
Обозначается
Производитель
Активность Тромбина
на поверхности сгустка крови:
(Объем сгустка 50 Лл,
Поверхность: 0,33 см2)
Сгусток крови 0,079 6 0,057 МЕ
Коммерческий фибрин
герметики
ArtissVR (Baxter AG, Вена) 4 МЕ мл 1 2,5–6,5 МЕ мл 1 0,033 6 0,003 МЕ
TisseelVR (Baxter AG, Вена) 505 МЕ мл 1 400-625 МЕ мл 1 2.24 6 0.53 МЕ
EvicelVR (Этноним Соммервилль,
Нью Джерси)
820 МЕ мл 1 800-1200 МЕ мл 1 2,91 6 0,37 МЕ
Подготовленные тестовые образцы ФС 4 Ме ‘низкий тромбин " 0,033 6 0,003 МЕ
(идентично ArtissVR )
FS 505 МЕ ‘средний тромбин " 2.24 6 0.53 МЕ
(идентично TisseelVR )
FS 820 МЕ ‘высокий тромбин " 2.85 6 0.22 МЕ
Активность тромбиновых компонентов трех различных, коммерчески доступных ФС (ArtissVR , TisseelVR , Execelvr ) приведена в 4, активность которых
поверхность фибрина отображается в последнем столбце. Человеческие сгустки крови служили физиологическим ориентиром. (n ¼ 3-5).
предположили, что тромбин играет ключевую роль в обеспечении совместимости клеток. Коллективные, различные эффекты тромбина жизненно важны для процесса заживления ран. Помимо своей основной функции расщеплять фибриноген до фибрина в каскаде свертывания крови и таким образом индуцировать образование фибринового сгустка,было показано, что тромбин 2 обладает неоднозначными свойствами в клеточных культурах.15,16
В этих исследованиях мы смоделировали ситуацию, когда сгустки FS были применены для поддержки регенерации кожи с помощью NHEK, которые были посеяны поверх сгустков FS. Для выяснения специфической роли тромбина в опосредовании клеточных эффектов были использованы три идентичных препарата ФС, различающихся только концентрацией тромбина. Мы демонстрируем, что высокие концентрации тромбина в сгустках ФС не только снижают пролиферацию 13, но и индуцируют апоптоз в клетках NHEK.
Материал и методы материалы
FS Artiss ® и Tisseel ® были предоставлены компанией Baxter AG (Вена, Австрия), Evicel ® была приобретена у Ethicon (Соммервилл, Нью-Джерси).
Клеточная культура
Криоконсервированные нормальные эндотелиальные кератиноциты человека (NHEK) (PromoCell, Гейдельберг, Германия) размораживали и культивировали в соответствии с протоколом производителя и выращивали до 70-80% слияния перед сбором урожая. Для экспериментов использовались проходы от 3 до 8.
Препарат фибринового сгустка
Фибриноген и тромбин восстанавливали в соответствии с протоколом производителя: лиофилизированный белковый компонент герметика Artiss ® уравновешивали при комнатной температуре и восстанавливали в 3000 ки мл-1 растворе апротинина при 37°С. уравновешенный при комнатной температуре лиофилизированный компонент тромбина восстанавливали в 40 мм растворе CaCl2 с получением 4 МЕ мл-1 раствора тромбина. Компоненты тромбина 505 и 820 МЕ мл-1, но в остальном идентичного состава были получены из концентрированного тромбинового запаса
[1014 МЕ мл-1, код продукта: VN0301096, номер партии: VNFEK028A, Baxter AG, из производства после ультрафильтрации 3, Тест эндотоксина <0.50 (предел спецификации <1.67)], который был разбавлен 25% HSA и NaCl до соответствующих концентраций.
Для образования тромба равные количества компонентов фибриногена и тромбина смешивали в культуральной пластинке ткани на вихревом смесителе. Сгустки инкубировали при 37°С в течение 1 ч, а затем промывали в течение ночи раствором PBS/апротинина (1500 ки мл-1) при комнатной температуре перед посевом клеток.
Активность тромбина
Компоненты тромбина трех различных коммерчески доступных ФС были протестированы на тромбиновую активность с помощью мутного анализа с использованием системы коагуляции Беринга (BCS) (Siemens Healthcare Diagnostics, Deerfield, IL).
Для измерения активности тромбина на поверхности сгустка FS использовали набор для определения активности тромбина SensoLyte ® 520 *Fluorimetric* (AnaSpec, Fremont, CA). Сгустки 50 pL полимеризовали в 96-луночной пластине (площадь поверхности 0,33 см2 на лунку) и промывали в течение ночи раствором PBS/апротинина (1500 ки мл-1). Анализ проводился в соответствии с протоколом производителя.
Подготовка к сканирующей электронной микроскопии (Сэм)
Сгустки фибрина (200 pL) фиксировали в фиксирующем растворе SEM, содержащем 0,1 м какодилата натрия и 2,5% глутарового альдегида. Затем сгустки промывали, обезвоживали 2,2-диметоксипропаном и сушили гексаметилдиссилазаном. Сгустки покрывают напылением из палладия и золота в Эми-тек (Мольфетта, Италия) распыления нанесения покрытий SC7620 и проанализированы в сем фирмы JEOL 6510 (фирмы JEOL, Токио, Япония).
Количественное определение NHEK путем измерения лактатдегидрогеназы
Клетки подсчитывали и суспендировали в культуральной среде клеток. В каждом эксперименте от трех до шести сгустков (300 pL) на рецептуру высевали по 20 000 клеток / сгусток в 24 лунке
тарелка. Контролем служили сгустки, наложенные на культуральную среду клеток. Сгустки инкубировали с клетками при 37°C/5% CO2. В некоторые моменты времени клетки лизируются с 9% TritonX-100. Аликвоты лизата (3х 50 ЛП) из каждой скважины были переданы в 96-луночный планшет и 50 ЛП ЛДГ/ну субстрата (CytoTox96 анализа субстратной смеси, Invitrogenбыл, Карлсбад, Калифорния) были добавлены. Затем пластины инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 30 мин и измеряли поглощение при 490 Нм.
Морфология клеток
Образование сгустков и посев клеток проводили так, как описано выше. Клетки выращивали на фибриновых сгустках (300 pL) в течение 24 и 48 ч. После фиксации и пермеабилизации клетки окрашивали 10 пг мл-1 ТРИТК-фаллоидином/PBS и 5 пг мл-1 4', 6-диамидино-2-фенилинолом (DAPI) под световой защитой. Микроскопия проводилась на AxioObserver Z1 в инвертный микроскоп (объектив Zeiss, Jena, Германия).
Окрашивание живых и мертвых клеток
Клетки выращивали поверх 300 сгустков pL FS в течение 24 или 48 ч в 24-луночных пластинах. Для окрашивания живых и мертвых клеток (Life/Dead ® viability / cytotoxicity kit for mammalian cells; Invitro-gen, Carlsbad, CA) клетки инкубировали с кальцеином AM и раствором флуоресцентного красителя этидия гомодимер-1 в соответствии с протоколом производителя. Микроскопия проводилась на AxioObserver Z1 в инвертный микроскоп (объектив Zeiss, Jena, Германия). Красные и зеленые флуоресцентные сигналы были количественно измерены с помощью считывателя пластин Synergy MX (Bio-Tek, Winooski, VT) при 485 и 528 Нм.
Гирудин ингибирует тромбин, связанный со сгустком крови
Фибриновые сгустки (100 ПЛ) получали с 820, 505 или 4 МЕ мл-1 тромбинового компонента в 96-луночных пластинах и промывали в течение ночи раствором PBS/апротинина (1500 ке мл-1). Сгустки инкубировали в течение 1 ч при 37°С либо с dH2O (контроль), либо с 50 pL 200 МЕ мл-1 раствора гирудина (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO) и затем промывали. Alexa Flu-or ® 546 конъюгированный фибриноген (500 ПГ) (молекулярные зонды, Eugene, OR) смешивали с 1 мл фибриногенного компонента ФС. 50 ПЛ аликвоты смеси наносили на промытые фибриновые сгустки для исследования образования сгустков, индуцированного связанным с фибрином тромбином. После 15-минутной инкубации при 37°С сгустки промывали для удаления несвязанного фибриногена и измеряли флуоресценцию (искл. 520 Нм / Эм. 580 Нм; считыватель пластин Synergy MX, Bio-Tek, Winooski, VT).
Для количественного определения клеток на гирудин-заблокированных фибриновых сгустках (300 pL в 24-луночных пластинах) сгустки инкубировали с гирудином за 1 ч до посева клеток. Концентрацию гирудина определяли по результатам анализа активности тромбина SensoLyte ® 520 путем экстраполяции значений тромбина, измеренных в 96-луночной пластине, на увеличенную площадь поверхности 24-луночной пластины.
Анализ активности каспазы
Сгустки FS (100 pL) готовили в 96-луночной пластине и промывали в течение ночи раствором PBS/апротинина (1500 KIE
мл-1). Клетки (40 000/сгусток) высевали на сгустки и измеряли активность cas-pase через 4 ч с помощью одноэтапного флуорометрического анализа с субстратом DEVD-Rhodamine110 в соответствии с протоколом производителя (гомогенный Каспазный анализ ® , Roche Applied Sciences, Базель, Швейцария). Количество клеток определяли как контроль нагрузки с помощью анализа ЛДГ.
Вестерн-блот
Клетки выращивали в шестилучевых пластинках до 90% слияния. Затем клетки покрывали фибриновым сгустком (1 мл лунки-1) и покрывали средой (2 мл лунки-1). Фибриновые сгустки удаляли через 4 ч. клетки лизировали, а концентрацию белка лизатов измеряли методом DC-protein assay (BD Biosciences, San Jose, CA).
Белки (40 ПГ / л) исследовали на 10% бис-Трис SDS PAGE gels (Invitrogen, Carlsbad, CA). Первичные антитела Trail-R2 / DR5 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA) и ERK1/2 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) были разведены 1:1000 и 1:500. Вторичных антител использовали: IRDye ® коза-кролик-800 Нм, IRDye ® коза-а-мыши 680 Нм, литий-кор, Линкольн, Небраска; обнаружение сигнала контролируется с Odysseey система визуализации от Li-кор (Линкольн, Небраска). Сигнал Trail-R2 / DR5 был нормализован с общим сигналом ERK1 / 2.
Статистика
Данные представлены в виде среднего ± SEM по крайней мере трех независимых экспериментов, а статистический анализ проводился с помощью программного обеспечения MiniTab 15 статистические сравнения для всех экспериментальных установок основывались на двух выборочных t-тестах, ANOVA или общей линейной модели с использованием критерия Тьюки при р < 0,05, рассматриваемого как значимый.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Активность фибрина тромбин связывается
Были выбраны три коммерчески доступных ФС, которые значительно различаются по концентрации тромбиновых компонентов: Artiss ® (Baxter AG; 4 МЕ мл-1), Tisseel ® (Baxter AG; 500 МЕ мл-1) и Execel ® (Ethicon; 1000 МЕ мл-1). Поскольку диапазоны спецификации тромбинового компонента широки, для измерения фактической концентрации тромбина каждого герметика был использован коагуляционный анализ: 4 МЕ мл-1 тромбина было измерено в компоненте Artiss ® thrombin; 505 МЕ мл-1 в компоненте тромбина Tisseel ® и 820 МЕ мл-1 в компоненте тромбина Execel ® (таблица I). Поскольку тромбин остается активным после свертывания, активность связанного с фибрином тромбина оценивали с помощью теста, который преимущественно измеряет активность на поверхности сгустка. Наблюдалась четкая зависимость между концентрацией тромбина в компонентах тромбина и результирующей активностью тромбина на поверхности сгустка. Интересно, что активность фибринсвязанного тромбина сгустков крови человека и фибриновых сгустков, приготовленных с раствором тромбина 4 МЕ мл-1, оказалась сопоставимой и лежит ниже 1 МЕ мл-1 (табл.I).
Сканирующая электронная микроскопия фибриновых сгустков, полученных при низких и высоких концентрациях тромбина
Фактические концентрации тромбина, определенные в компонентах тромбина Artiss ® , Tisseel ® и Execel ® , использовались в качестве эталона для получения ФС этих концентраций тромбина, но с идентичным в остальном составом всех других ингредиентов. Для этого мы использовали фибриногенный компонент Artiss ® R и высококонцентрированный раствор тромбина, который разбавляли до требуемых концентраций (505 МЕ и 820 МЕ мл-1). Анализ методом Сэм трехмерных структур фибриновых сгустков, полученных с использованием растворов тромбина 4 и 820 МЕ мл-1, показал, что плотность и толщина фибриновых волокон не изменялись (Рис.1). 1). Сэм-снимки показывают, что на структуру сгустка не влияли концентрации тромбина 4 и 820 МЕ мл-1.
Количество адгезивных клеток на фибриновых сгустках с различной концентрацией тромбина
Для оценки взаимодействия NHEK с фибриновыми сгустками, полученными с низкой (4 МЕ мл-1), средней (505 МЕ мл-1) и высокой концентрациями тромбина (820 МЕ мл-1), оценивали количество адгезивных клеток NHEK в разные моменты времени. Через 24 и 48 ч значительно меньшее количество клеток прилипло к фибриновым сгусткам, полученным с высокой (24 ч: 75,7%; 48 ч: 57,7%) и средней концентрациями тромбина (24 ч: 85,6%; 48 ч: 70,4%), по сравнению с фибриновыми сгустками, полученными с низкой концентрацией растворов тромбина (были установлены на 100%) (рис. 2). Количество клеток на фибриновых сгустках, содержащих большое количество тромбина, уже значительно уменьшалось после 4 ч (66,4%) адгезии по сравнению с низкой концентрацией тромбина.
Морфология клеток на фибриновых сгустках с различной концентрацией тромбина
Поразительные различия в морфологии клеток наблюдались между фибриновыми сгустками, полученными из низко -, средне-и высококонцентрированных растворов тромбина. В присутствии низких количеств тромбина распространение NHEK наблюдалось через 24 ч. С увеличением концентрации тромбина морфология клеток становилась все более и более ухудшенной (Рис.2). 3). Фибриновые сгустки, полученные высококонцентрированными растворами тромбина
не удалось поддержать распространение клеток, и NHEK показал округлую морфологию [рис. 3 (C, F)].
Ингибирование фибрина связаны активность тромбина гирудина по
Гирудин был установлен как ингибитор свободного и связанного с фибрином тромбина.17 мы использовали гирудин для проверки гипотезы о том, что высокая активность тромбина в фибриновых сгустках оказывает негативное влияние на совместимость клеток.
Блокирующая эффективность гирудина была подтверждена экспериментом, в котором контролировалась способность связанного с фибрином тромбина способствовать росту фибринового сгустка. Как показано на Рис.4, гирудин ингибирует сборку меченного флуоресценцией фибриногена на предварительно сформированные сгустки фибрина. По сравнению с разблокированными высокими тромбиновыми сгустками, которые были установлены на 100% абсорбцию, сборка ~ 73 и 40% абсорбции Меченого фибриногена была измерена для средних и низких тромбиновых сгустков соответственно. Блокируя активность тромбина гирудином, сборка Меченого фибриногена для среднего и высокого фибринового сгустка была значительно снижена до уровня низких тромбиновых сгустков. Фибриноген в сборе
Рисунок 2. Количество адгезивных NHEK на фибриновых сгустках, полученных с различной концентрацией тромбина. Количество клеток оценивали после 4, 24 и 48 ч инкубации путем измерения количества лактатдегидрогеназы. *указывают на достоверно различающееся количество клеток по сравнению с 4 Ме мл_1 тромбиновых сгустков Р < 0,05; (n = 3).
низкие тромбиновые сгустки оставались неизменными при блокировании гирудином.
Для оценки влияния ингибирования тромбина на совместимость клеток сгустки фибрина, полученные из низко -, средне-и высококонцентрированных растворов тромбина, обрабатывали гирудином перед посевом NHEK и оценивали количество клеток. Количество клеток существенно не изменялось при низком уровне тромбина FS при лечении гирудином, тогда как при среднем и высоком
Рисунок 4. Гирудин блокирует фибриносвязанную тромбиновую активность тромбиновых сгустков низкого, среднего и высокого уровня. Гирудин блокировал фибриновые сгустки, а разблокированные контрольные сгустки инкубировали с Меченым фибриногеном Alexa 568 и измеряли флуоресценцию при 520-580 Нм. Абсорбция разблокированных тромбиновых сгустков была установлена на уровне 100%. Относительное поглощение показано для всех сгустков. В качестве контроля использовались немаркированные сгустки крови. *p < 0,05 приведены результаты четырех независимых экспериментов (n = 3 сгустка/эксперимент)
концентрированные тромбиновые сгустки блокирование гирудином вызывало достоверно увеличенное количество клеток по сравнению с необработанными сгустками ФС после 24 (505 МЕ мл-1: р = 0,015; 820 МЕ мл-1: р = 0,01) и 48 ч (505 МЕ мл-1: р = 0,03; 820 МЕ мл-1: р = 0,029) инкубации. Репрезентативный эксперимент из трех показан на Рис.5.
Индукция гибели клеток фибрином тромбин связывается
Чтобы проверить, вызвано ли снижение количества клеток на сгустках фибрина с высоким содержанием тромбина гибелью клеток, было проведено живое / мертвое окрашивание NHEK. Как показано на рис. 6 (а), высокая
Рисунок 5. Количество адгезивных NHEK на фибриновых сгустках с различной концентрацией тромбина ± гирудина. Общее количество клеток определяли путем измерения количества лактатдегидрогеназы лизированных клеток после 24 ч и 48 ч инкубации. * укажите значительно отличающиеся номера клеток по сравнению с разблокированными сгустками. Детальные p-значения указаны на графике. (n = 3, каждый с тремя-девятью отдельными сгустками в группе).
Рисунок 6. А: процент мертвых клеток на сгустках фибрина. Красный и зеленый сигналы были оценены считывателем пластин при 530 и 620 Нм и приведены в процентах от мертвых клеток по отношению к живым клеткам. На графике показаны средние результаты трех независимых экспериментов. * указывает на значительную разницу по сравнению с 4 Ме мл_1 тромбиновых сгустков. Б: живое / мертвое окрашивание клеток на сгустках фибрина. Клетки культивировали в течение 24 ч на фибриновых сгустках, приготовленных с использованием различных растворов тромбина: 4, 505 и 820 МЕ мл_1. Зеленое пятно (Кальцеин АМ) указывает на живые клетки, а красное пятно (Этидий Гомодимер 1) - на мертвые клетки.
совместимость ФС с NHEK, ключевым типом клеток для регенерации кожи.18,19 поскольку коммерчески доступные ФС сильно различаются по своему составу, знание факторов, влияющих на поведение клеток, поможет выбрать подходящие продукты для регенерации тканей.1,4,5
Сгустки ФС были получены из общего компонента фибриногена и объединены с компонентами тромбина, полученными из одного исходного материала. Эта стратегия гарантировала, что концентрация тромбина была единственной переменной. Выбранные концентрации тромбина представляют собой диапазон, предлагаемый в коммерчески доступных ФС (Artiss ® , Tisseel ® , Evicel ® ).
В дополнение к другим своим функциям тромбин 2,15,16,20 обладает способностью влиять на трехмерную структуру сгустка в определенном диапазоне концентраций.Кроме того, было показано, что изменение структуры фибрина имеет значение для заживления ран.24,25 наши данные Сэм не выявили структурных различий между сгустками ФС, приготовленными с компонентами тромбина в диапазоне от 4 до 820 МЕ мл-1. Это подтверждает предыдущие исследования, описывающие различия в структуре тромба, проявляющиеся только при очень низких концентрациях тромбина (0,001-1 МЕ мл-1).Таким образом, маловероятно, что наблюдаемые эффекты были вызваны структурными различиями, а не содержанием тромбина. Наши результаты показывают, что поверхностная активность тромбина на сгустках ФС коррелирует с количеством тромбина, используемого для образования сгустка. Это иллюстрируется экспериментом, показывающим сборку меченного флуоресценцией фибриногена на предварительно сформированных сгустках фибрина, и
его ингибирование гирудином. Все сгустки, обработанные гирудином 10 МЕ, показали такую же низкую поверхностную тромбиновую активность, как и необработанные сгустки с низким содержанием тромбина. Низкие тромбиновые сгустки оставались неизменными при блокировании, так как ингибирующее влияние на активность тромбина меньше, чем вариация анализа. Остаточная флуоресценция 30-40%, измеренная на низких тромбиновых и гирудиновых заблокированных сгустках, по-видимому, обусловлена неспецифической сборкой Меченого фибриногена. Мы предположили, что клеточные сигнальные события, вызванные связанным с фибрином тромбином, ответственны за наблюдаемые различия в совместимости клеток. В зависимости от концентрации тромбина взаимодействие NHEK со сгустками ФС либо поддерживалось, либо ингибировалось. При посеве поверх сгустков ФС, приготовленных с 820 МЕ млт1 тромбина, NHEK показал снижение прикрепления, снижение пролиферации, ухудшение морфологии и увеличение количества мертвых клеток. Эти результаты не согласуются с предыдущими исследованиями, показывающими, что клеточные реакции на тромбин включают повышенную пролиферацию, синтез коллагена, миграцию и индукцию ангиогенеза.28,29 однако тромбин оказывает разнообразные эффекты, зависящие от концентрации и клеточного состава
тип.13
Интересно, что количество клеток на высоких тромбиновых сгустках, по-видимому, значительно увеличивается между 4 и 24 часами. Очень вероятно, что этот эффект не отражает пролиферацию, но может быть вызван задержкой прикрепления, вызванной высокими концентрациями тромбина, поскольку тромбин был описан для модуляции адгезии клеток к фибриновым сгусткам дозозависимо.30,31 кроме того, аналогичные результаты были опубликованы с NHEK по Фибриновым сгусткам Execel ® , которые напоминают сгустки с высоким содержанием тромбина.14 пороговая концентрация тромбина, которая приводит к негативным эффектам, часто зависит от типа клеток.15,16,32 противоречивые эффекты тромбина могут быть связаны с рецепторами, участвующими в передаче сигнала. Тромбин действует как сигнальная молекула путем прямого связывания с PAR-1 или PAR-3, которые экспрессируются на поверхности многих типов клеток, включая кератиноциты.33 тромбин, связанный с фибриновым сгустком, способен активировать PAR-1 и индуцировать пролиферацию клеток.34 с другой стороны, было также
апоптоз-индуцирующий лигандный рецептор 2). Экспрессия Trail-R2 была повышена в NHEK, культивированном на сгустках FS, приготовленных с 505 или 820 МЕ мл-1 тромбина, по сравнению с сгустками, приготовленными с 4 МЕ мл-1. Активированный след-Р2 сигналов посредством активации каспазы 8 до опосредующие апоптоз.39,40 Симончини, Njock, и Robert41 показали, что тропа, лиганд след-R2 представляет собой целевой тромбина и его экспрессия значительно повышается при стимуляции тромбина на эндотелиальные клетки, таким образом, подтверждающие непосредственную связь между тромбином и Trail-R2 с сигнализации. Взятые вместе, эти данные согласуются с наблюдаемой индукцией активности каспазы 3 и подтверждают вывод о том, что высокое количество связанного с фибрином тромбина индуцирует апоптоз в NHEK.
Для дальнейшей проверки того, что эти наблюдаемые эффекты являются тромбин-зависимыми, гирудин был использован для блокирования тромбин-индуцированной сигнализации. Гирудин является физиологическим необратимым ингибитором растворимого и связанного с фибрином тромбина. Блокирование фибриносвязанного тромбина гирудином снижало уровни активности каспазы 3 и 7 клеток, культивированных на сгустках ФС, приготовленных с 820 МЕ мл-1 тромбином, почти до уровня, наблюдаемого на сгустках, приготовленных с 4 МЕ мл-1 тромбином, что подтверждает гипотезу о том, что тромбин отвечает за регуляцию этих показателей апоптоза. Активность каспазы также проверялась в другие моменты времени. Аналогичная картина активности наблюдалась через 7 ч, но никакой регуляции не было обнаружено через 30 ч (данные не показаны). Кроме того, количество клеток было увеличено на сгустках FS, инкубированных с гирудином, и оценка морфологии показала улучшенную морфологию NHEK при блокировании гирудином высоких тромбиновых фибриновых сгустков (данные не показаны). Мы предполагаем, что улучшенная совместимость клеток является прямым следствием блокирования тромбин-зависимых вредных сигнальных путей, поскольку сам гирудин, как было описано, не оказывает влияния на морфологию клеток.42 однако способность поддерживать клеточную пролиферацию была лишь частично восстановлена блокированием гирудина. Это может быть связано с тем, что гирудин ингибирует фибринсвязанный тромбин только с эффективностью 70-80%.43
Это исследование оценивало, влияет ли активность тромбина, присутствующего на поверхности сгустков ФС, на совместимость ФС с NHEK, ключевым типом клеток для регенерации кожи.18,19 NHEK, посеянные на сгустки FS, сделанные с 820 МЕ мл-1 тромбина, показали снижение прикрепления, снижение пролиферации, ухудшение морфологии и увеличение количества мертвых клеток. С другой стороны, сгустки ФС, полученные с низкой концентрацией тромбина (4 МЕ мл-1), поддерживают прикрепление NHEK и распространение клеток. Все эксперименты, проведенные со средними тромбиновыми сгустками (505 МЕ мл-1), подтвердили сильную дозозависимость тромбина. Было обнаружено, что значения адгезии, пролиферации и активности каспазы находятся между значениями низких и высоких тромбиновых сгустков. Здесь мы могли бы впервые продемонстрировать, что высокие концентрации тромбина ответственны за индуцирование апоптоза в клетках NHEK, и поэтому дать намек на то, что низкие концентрации тромбина в FS лучше подходят для применения in vivo, чем высокие концентрации тромбина FS. Необходимо показать актуальность наших результатов in vivo (соответствующие исследования на животных продолжаются), но многие другие уже показали, что концентрация тромбина значительно влияет на успех использования ФС в качестве носителя кератиноцитов.13,44-46
Высокие концентрации тромбина в фибриновых герметиках индуцируют апоптоз кератиноцитов человека
Альфред Гугерель, 1, 2 Клаудия ШОС-Шлейтнер,1 Сюзанна Вольбанк, 2, 3 Сильвия Нюрнбергер,2 Хайнц Редль,2, 3 Галерея Хайнца, 1 Андреас Гоппельт,1 Микаэла Биттнер,1 Вальтрауд Пастейнер1
biosurgery, Baxter Innovations GmbH, Industriestrasse 131, 1221 Вена, Австрия
2 Институт экспериментальной и клинической травматологии им. Людвига Больцмана в Исследовательском центре AUVA, Donaueschingenstrasse 13, 1200 Вена, Австрия 3аустрийский кластер регенерации тканей, Австрия
Получено 6 июня 2011 г.; пересмотрено 13 октября 2011 г.; принято 17 октября 2011 г.
Опубликовано в Интернете 23 февраля 2012 года в онлайн библиотеке Wiley (wileyonlinelibrary.com). DOI: 10.1002/jbm.а.34007
Медицинский хирургический клей в пластической хирургии «Криофит»
Фибриновый клей появился в результате многолетних исследований и сразу же получил широкое распространение в пластической хирургии.
Он успешно используется во время подтяжки лица, пластики тела.
Фибриновый клей завоевал себе славу исключительно важного компонента эстетической хирургии, который не только отличается эффективностью, но и быстрым действием: за 5-15 секунд после нанесения начинается процесс застывания, а уже через 30 секунд на обрабатываемой раневой поверхности образуется надежный слой фибриновой пленки, которая стимулирует нормальный процесс свертывания крови и склеивания тканей. Возможность возникновения типичных послеоперационных кровотечений и гематом сведена к минимуму, к тому же процесс заживления проходит значительно быстрее - клей обладает антибактериальным эффектом.
Современный помощник любого хирурга - медицинский клей «Криофит»
Фибринтромбиновый клей (ФТК) «Криофит» применяется в качестве гемостатического средства для остановки кровотечения, а также для соединения тканей без использования шовных материалов при проведении хирургических операций. «Криофит» устраняет недостатки, связанные с наложением швов, сокращает длительность операций, снижает кровопотери, упрощает операционную технику остановки кровотечений.
Первый фибриновый хирургический клей «Криофит»
Фибринтромбиновый клей (ФТК) «Криофит» применяется в качестве гемостатического средства для остановки кровотечения, а также для соединения тканей без использования шовных материалов при проведении хирургических операций в ожоговой, пластической хирургии, онкологии, нейрохирургии, гинекологии, офтальмологии, стоматологии и др., позволяет снизить в 1,5 раза кровопотери, что уменьшает трансфузию карантизированной плазмы и взвеси эритроцитарной массы, сокращает время проведения операций и послеоперационный период, резко уменьшает количество реопераций. Хирургический клей «Криофит» могут применять все лечебно-профилактические учреждения, в составе которых имеются хирургические отделения, а также клиники стоматологии, офтальмологии и пластической хирургии.
Хирургический клей «Криофит» в ортопедии
Фибринтромбиновый клей (ФТК) «Криофит» применяется в качестве гемостатического средства для остановки кровотечения, а также для соединения тканей без использования шовных материалов при проведении хирургических операций в ортопедии, травматологии, ожоговой, пластической хирургии, онкологии, нейрохирургии, гинекологии, офтальмологии, стоматологии др. Его применение позволяет снизить в 1,5 раза кровопотери, сокращает время проведения операций и послеоперационный период, резко уменьшает количество реопераций.
Клей для ран «Криофит» история производства
Не всё получается с первого раза, тем более в конкурентном и сложном секторе медицинских изделий. Иногда даже заведомо прорывная идея выстреливает спустя годы после обнародования. Но, как рассказал «Экспиру» генеральный директор компании «Плазма-ФТК» Константин Былов, нужно двигаться от одной неудачи к другой, не теряя оптимизма. И только так можно достичь успеха.
Технологии изготовления клея из крови от отечественных ученых
Дайте совет: что, по-вашему, нужно, чтобы выйти на рынок?
- Для выхода на рынок нужна в первую очередь оригинальная научно-техническая идея, защищенная патентом и обеспеченная финансированием.
Применение медицинского клея Криофит в нейрохирургии
Компания «Плазма ФТК» получила поддержку Фонда содействия в рамках программы «СТАРТ». Проект фибринтромбинового клея был одобрен экспертным жюри в 2009 году, финансирование разработки длилось три года.
Создание хирургического клея «Криофит»
Компания «Плазма-ФТК» удешевила производство клея гемостатика из плазмы крови пациента. Раствор под торговой маркой «КРИОФИТ» позволяет уменьшить кровопотери, окончательно остановить кровотечение и вероятность осложнений после операций. Теперь его можно готовить на базе мобильного комплекса. Но массовый спрос на новый продукт появится только после включения клея в стандарты проведения хирургических операций Минздрава РФ.